线粒体DNA的结构特点

线粒体拥有独立于核基因外的遗传物质-mtDNA，mtDNA为环状闭合双链分子，由编码区和非编码区（D-环）组成，编码区编码参与氧化磷酸化和生成ATP所必需的多肽，非编码区是控制线粒体基因转录的主要区域，其内含有控制mtDNA转录和翻译的调节序列，mtDNA拷贝数具有高度遗传性，mtDNA 突变最终可引起氧化磷酸化障碍、ATP生成减少，造成线粒体功能下降，同时会影响mtDNA的复制速度改变及其拷贝数。

与核基因（nDNA）相比，mtDNA分子量小，但突变率高，可达核DNA的5-10倍，这与mtDNA缺乏组蛋白保护、损伤修复系统低效以及位置上靠近线粒体内膜电子传递链而易受活性氧损伤等因素有关。 

线粒体基因组的高通量测序技术应用

现在临床研究和科学研究上逐渐倾向于采用高通量测序（Next generation sequencing，NGS）的靶向panel测序、全线粒体基因组测序、全外显子测序（Whole exome sequencing，WES）以及全基因组测序（Whole genome sequencing，WGS）来获得线粒体基因组。这样做，在提高分析效率的同时，通过增加样本量也提高了筛选致病变异的灵敏度。

⏩靶向panel测序

NGS应用于线粒体疾病的初期，仅仅针对线粒体基因组的部分区域进行测序，包括编码呼吸链的多肽和已知的疾病相关基因。或者选择MitoCarta中列出的所有线粒体相关基因（包括mtDNA和nDNA），该panel被称为“MitoExome”。

⏩全线粒体基因组测序

使用NGS进行全线粒体基因组测序可以识别任何mtDNA变异，并准确评估变异的异质性水平。许多线粒体诊断中心，在进行WES或WGS之前，首先对mtDNA进行测序用于识别潜在的致病性mtDNA变异或排除mtDNA变异。但需要注意的是，许多致病mtDNA变异仅存在于临床上受影响的组织中，如骨骼肌。

⏩全外显子测序

本质上，WES是对基因组外显子区域的靶向测序。但是，WES数据中仍存在大部分测序数据来自非目标区域，其中就包括线粒体基因组的数据。由于相比二倍体的核基因组，线粒体基因组有成千上百个拷贝，因此脱靶mtDNA序列要比脱靶nDNA序列要多30-120倍。

值得注意的是，捕获的mtDNA序列的比例与原始总DNA提取物中mtDNA的丰度有关。例如，心脏和骨骼肌中单个细胞所含的mtDNA比外周血多。由于mtDNA高拷贝数的特性，导致野生型和突变型mtDNA的混合比例（异质性）理论上可以连续从0%到100%。而且致病性mtDNA突变通常在携带者中是高异质或同质的，对于无症状的致病性mtDNA突变则是低异质的。另一方面，mtDNA拷贝数是高度可变的，并被认为与多种疾病，甚至癌症有关。因此，mtDNA拷贝数对于线粒体基因组分析是一个重要的统计数据。由于测序数据的覆盖度与染色体的数量成正比，因此从WES数据中可以估计mtDNA拷贝数。

⏩全基因组测序

WGS能够检测人类基因组上的所有基因变异，有助于进一步提高线粒体疾病的诊断率。有研究证明传统的基于PCR的方法与WGS数据对mtDNA变异的分析具有高度一致性。在拷贝数方面，根据WGS数据估计的mtDNA拷贝数更加可靠。

线粒体基因组的生信分析

在人体中，线粒体的异质性是常见的问题，根据变异的位置、频率和其他内源性或外源性因素不同，可能对人类健康产生重大影响。因此，准确检测和量化此类变异对于线粒体DNA( mtDNA)疾病的诊断、遗传咨询和治疗非常重要。

⏩线粒体变异数据库

相比nDNA，mtDNA变异的人群数据库的数量少很多。幸运的是，从已有的WES和WGS数据中重新分析获得mtDNA序列得到广泛接受和应用。目前已经有了多个大样本量的人群线粒体数据库：

➤Mitomaphttp://www.MITOMAP.org

MitoMap是人类线粒体基因组数据库，最早发布于1996年，随着期间线粒体DNA相关研究发展带来的信息量需求，曾于2013年重构了其数据构建和注释等方法。MitoMap网站提供了通过线粒体基因组坐标在线查询线粒体基因注释的功能，但更常用的场景是下载数据库后与annovar等注释工具结合，构建注释数据库进行基因注释，构建时需要注意其线粒体坐标与人参考基因组版本之间的对应关系。

➤MitoProteomehttp://mitoproteome.org/

MitoProteome网站提供了数据检索和注释浏览功能，当前版本包含人线粒体相关的1705个基因和3625个蛋白质数据，网站下载数据提供sql格式，通过PostgreSQL构建数据库。MitoProteom于2004年发布的最初版本包含847个线粒体蛋白序列，通过公共数据库和对源于人类心脏的线粒体质谱分析得到。于2015年从以蛋白为核心的系统更改为以基因为核心的系统，通过对基因进行基因组相关、可变剪切产生的mRNA相关以及蛋白质相关信息的汇总，构建相应注释系统并展示。

➤gnomADGenome Aggregation Database

作为规模最大且开源的人类变异数据库，于2020年11月在gnomAD v3.1中首次公开了mtDNA变异，共纳入56,434个来自WGS数据的mtDNA序列，包括10,850个mtDNA变异。

➤HelixMTdb 数据库https://www.helix.com/pages/mitochondrial-variant-database

是基于196,554无血缘关系人的WES数据，共检测到15,035个线粒体变异。其中绝大部分样本为欧洲人群。

➤HmtDB数据库http://www.hmtdb.uniba.it:8080/hmdb

纳入具有健康和疾病表型的样本，旨在为群体遗传学和临床医生提供支持，用于评估特定mtDNA变异的致病性。需要注意的是，HmtBD和Mitomap的mtDNA序列均来自GenBank，因此两个数据库之间的样本来源存在很大的交集。

此外，一些nDNA变异常用的疾病数据库中也有mtDNA变异的临床的信息，例如Clinvar、Clinvar Miner和OMIM。除此之外，上述提到的Mitaomp和HmtDB数据库中也包含变异的致病性信息。截止2022年7月1日，Mitomap 整理了455个 rRNA/tRNA 突变和 545 个编码区/非编码的变异被报道过与疾病有关，其中只有 97 个变异被归纳为确认致病（Cfrm）的变异。

⏩ 线粒体变异有害性预测工具

一些用于评估nDNA编码区变异有害性的工具，同样适用于mtDNA编码区变异，包括CADD、PolyPhen-2、SIFT、Mutpred和PROVEAN。目前这几个工具已经被广泛应用于nDNA变异优先级排序。其中，MitImpact2中收集了多种不同mtDNA蛋白编码区变异有害性预测工具。这些原本设计用于评估nDNA编码区有害性的工具用在mtDNA编码区上有时会表现较差的准确性。相反，最近一些专门为mtDNA开发的工具表现出更好的性能。例如MToolBox、APOGEE和Mitoclass.1。

对于线粒体的tRNA变异，目前常用的有MitoTIP、MToolBox和PON-mt-RNA。MitoTIP使用公开可供的数据库数据，再结合对所有已知线粒体tRNA不同位置变异的重要性评估tRNA变异的有害性，可从Mitomap中获得。需要注意的是，MitoTIP评分没有考虑变异的异质性。因此，研究人员应用过程中应考虑实际患者的异质性以及受影响和未受影响的家庭成员中的异质性情况。PON-mt-RNA是一个多因素评分，它关联 12 个特征，包括进化保守性、一级到三级结构，以及包括生物化学和组织化学在内的功能分析。MToolBoxs 是一个综合软件，可以用于分析来自NGS的人类线粒体序列以及线粒体变异异质性注释和致病性变异鉴定。